COLORACION GRAM CONSIDERACIONES ANALITICAS CONTROL DE CALIDAD

CONSIDERACIONES ANALÍTICAS:

III. CONTROL DE CALIDAD:

A.- Revisar la apariencia de los reactivos diariamente.

1. Si el cristal violeta tiene precipitado o sedimento , filtrar antes de usar.
2. Cambiar las soluciones de trabajo regularmente si no se han agotado con el uso normal. La evaporación puede afectar la efectividad de los reactivos.
3. Limitar el reuso de los envases de los colorantes de trabajo, descartándolo al menos mensualmente.

Nota: Los colorantes pueden estar contaminados. Cuando se sospecha de contaminación, usar un nuevo lote de colorantes.

B.- Controlar los procedimientos de coloración del laboratorio previo al uso de nuevos lotes de cada reactivo colorante y decolorante y al menos semanalmente en lo sucesivo, usando microorganismos gram-positivos y gram-negativos.

1. Preparar un caldo de cultivo debilmente turbio de Escherichia coli (ATCC 25922) y Staphylococcus aureus (ATCC 25923).
2. Realizar frotices usando 2 gotas por lámina dispersando hasta el tamaño de una moneda de 1 sol.
3. Fijar en metanol, se pueden  almacenar láminas fijadas a -20°C.
4. Colorear con el método de Gram.
5. Resultados esperados:
1. Bacilos Gram-negativos, rosados.
2. Cocos Gram-positivos, violeta intenso.
6. Alternativamente, con un palillo de madera quebrado obtener material de entre los dientes y aplicar al final de la lámina usada para el espécimen, separando esta área de la lámina con un marcador. Este método provee un control incorporado, con microorganismos gram-negativos y gram-positivos.

C.- Realizar acciones correctivas cuando el frotis coloreado preparado muestra evidencia de pobre calidad, las coloraciones son difíciles de interpretar, o las interpretaciones son imprecisas. Las características de coloración débil (p.e. organismos gram-positivos débilmente coloreados, retención de cristal violeta por organismos gram-negativos, coloración solo en los bordes del frotis, precipitados en la lámina, etc.) pueden ser debidas a la preparación del espécimen, reactivos, o procedimientos de la coloración. A continuación algunas de las causas comunes de pobres resultados de la coloración Gram.

1. Uso de láminas de vidrio que no han sido prelimpiadas o desengrasadas.
2. Las preparaciones del frotis son muy gruesas.
3. Sobrecalentamiento del frotis cuando se usa fijación por calor.
4. Lavado excesivo durante el procedimiento de coloración, especialmente si no ha sido apropiadamente fijado.
5. Precipitado en los reactivos.

D.- Adicionalmente, para asegurar la exactitud de la interpretación, se debe establecer un sistema para la revisión de reportes de la tinción de Gram.

1. Revisión de coloraciones Gram seleccionadas, realizadas por personal de supervisión para determinar necesidades de capacitación.
2. Comparar los resultados del cultivo final con reportes de la tinción de Gram, para chequear la morfología notada en la tinción de Gram pero no recuperada en el cultivo. Similarmente, la revisión tanto del frotis y el cultivo , cuando organismos en cantidades de 3 o 4+ son recuperados en cultivo, pero no observados en la tinción de Gram.

Nota: Un apreciable número de organismos vistos en el frotis pueden ser cultivados. Las discrepancias en este sentido deben ser investigados para errores en la evaluación de frotis o para indicaciones de futuros métodos de cultivo (p.e. anaeróbico, fúngico, etc).

3. Mantener un set de láminas de referencia para competencias de capacitación.

D. EXAMINACIÓN DEL FROTIS DIRECTO MICROSCOPICAMENTE:

1. Evaluar el frotis a bajo aumento 100X

1. Observación de cristales de colorante.

1. Si un exceso de precipitado de colorante es observado, decolorear y recolorear la lámina.
2. Alternativamente, preparar otro frotis coloreado con Gram.
3. Si el precipitado continua, usar colorantes frescos y filtrados en un contenedor limpio.

2. Determinar si el frotis ha sido apropiadamente decolorado

1. Dependiendo de la fuente del espécimen, el fondo debe ser generalmente claro o gram negativo.
2. Si glóbulos blancos están presentes, ellos aparecerán completamente gram negativos.
3. Si la lámina es sobrecoloreada, decolorear por completo y recolorear la lámina.

3. Determinar si el grosor del frotis es apropiado. Para una apropiada interpretación, las áreas no deberían tener mas de una capa de células, y no haber superposición de células. Preparar un nuevo frotis si es imposible de leer.

4. Para frotices preparados de especímenes clínicos, examinar muchos campos (10 para orina, 20 a 40 para otros especímenes) en bajo aumento para buscar evidencia de inflamación.

1. Observación la distribución de organismos y células.
2. Determinar áreas representativas de inflamación o purulencia y áreas de aparente contaminación con células epiteliales escamosas. Si no se aprecia purulencia, escoger áreas de aparente necrosis, restos de células inflamatorias, y moco.

2. Si hay células presentes, determinar el promedio del recuento de glóbulos blancos y células epiteliales en 20 a 40 campos representativos que contienen células.

3. En un área representativa con una predominancia de inflamación o purulencia, usando objetivo de 100x con aceite de inmersión, examinar 20 a 40 campos para observar la morfología celular y reacción Gram.

1. Si se observan raros organismos o no se observan organismos de un espécimen de un sitio normalmente estéril, pero el espécimen aparece purulento, o el especimen aparece sospechoso, realizar una revisión mas extensiva de la lámina.

4. Preservación de láminas de frotices directos.

1. Escurrir o limpiar con un papel secante el exceso de aceite de inmersión de la lámina y guardar la lámina para futuras evaluaciones por al menos 1 semana para permitir una revisión confirmatoria, especialmente si el cultivo u otro test de laboratorio son incongruentes.
2. Si una lámina necesita ser recoloreado para repetir la coloración Gram o preparar una coloración especial para confirmar hallazgos sugestionados por la coloración Gram, remover el aceite de inmersión con xyleno o un substituto del xileno y decolorear el frotis. Entonces recolorear la lámina.
3. Para almacenamiento de láminas o colecciones para docencia, estas deberán ser alamacenadas por mucho tiempo, remover el aceite de inmersión con xyleno y cubrir con una capa de sellador el frotis para prevenir la decoloración.